結(jié)果
pchA、pchC和pchF在菌株9866的2,4-二甲苯誘導(dǎo)細(xì)胞中高轉(zhuǎn)錄
pchC和pchF編碼的PCMH和pchA編碼的PHBDD被報(bào)道負(fù)責(zé)對甲苯酚的初始氧化，且PCMH對2,4-二甲苯有催化活性。因此，通過RT-qPCR進(jìn)行pchA、pchC和pchF在不同誘導(dǎo)條件下的轉(zhuǎn)錄分析，以探究PCMH和PHBDD是否也參與2,4-二甲苯的初始氧化。結(jié)果表明，2,4-二甲苯誘導(dǎo)條件下pchA、pchC和pchF的相對轉(zhuǎn)錄水平分別比未誘導(dǎo)條件高6.5、8.3和4.5倍。類似地，對甲苯酚誘導(dǎo)條件下這三個(gè)基因的相對轉(zhuǎn)錄比未誘導(dǎo)條件分別高4.6、4.5和1.5倍（圖2）。
圖2 通過RT-qPCR技術(shù)對9866菌株在誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)條件下pchA、pchC和pchF基因的轉(zhuǎn)錄分析。所有樣本均設(shè)置三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差
PCMH催化2,4-二甲苯氧化為4-羥基-3-甲基苯甲醛且其編碼基因?qū)?,4-二甲苯分解代謝是必需的
先前證明從菌株9866純化的PCMH對2,4-二甲苯有催化活性，但產(chǎn)物未被鑒定。本研究中，從3,000 ml培養(yǎng)物中純化得到總32 mg重組PCMH，比活性為0.18 U mg-1。化合物4-羥基-3-甲基苯甲醛被鑒定為產(chǎn)物，保留時(shí)間6.0分鐘，最大吸收波長286 nm，質(zhì)譜中穩(wěn)定的去質(zhì)子離子[M-H]- m/z=134.99（圖3）。因此，PCMH被確認(rèn)催化2,4-二甲苯氧化生成4-羥基-3-甲基苯甲醛。然而，推定的瞬時(shí)中間體4-羥基-3-甲基芐醇未被鑒定，因?yàn)槠錁?biāo)準(zhǔn)品商業(yè)不可用。
pchF編碼PCMH的黃素蛋白亞基，且對其酶活性必需。為驗(yàn)證pchF和pchC編碼的PCMH在2,4-二甲苯分解代謝中的作用，敲除pchF。結(jié)果顯示，9866△pchF不再能以2,4-二甲苯或?qū)妆椒幼鳛槲ㄒ惶荚春湍茉瓷L。然而，該突變體仍能在4-羥基-3-甲基苯甲醛或4-羥基苯甲醛上生長，這兩個(gè)產(chǎn)物分別來自PCMH催化的2,4-二甲苯或?qū)妆椒友趸?。另一方面，pchF互補(bǔ)突變體9866△pchF[pRK415-pchF]恢復(fù)在2,4-二甲苯或?qū)妆椒由仙L的能力。這表明pchF和pchC編碼的PCMH對菌株9866中2,4-二甲苯以及對甲苯酚的分解代謝是必需的。
PHBDD催化NADP+依賴的4-羥基-3-甲基苯甲醛氧化為4-羥基-3-甲基苯甲酸
表2 pchA編碼的PHBDD對4-羥基苯甲醛和4-羥基-3-甲基苯甲醛的動(dòng)力學(xué)參數(shù)
| 底物 | 輔因子 | Km (μM) | Kcat (min?1) | Kcat/Km (μM?1 min?1) |
|---|---|---|---|---|
| 4-羥基苯甲醛 | NADP+ | 3.57 ± 0.32 | 15.82 ± 0.36 | 4.4313 ± 0.2992 |
| 4-羥基苯甲醛 | NAD+ | 13.11 ± 1.78 | 0.10 ± 0.00 | 0.0076 ± 0.1111 |
| 4-羥基-3-甲基苯甲醛 | NADP+ | 6.36 ± 1.44 | 4.27 ± 0.27 | 0.6714 ± 0.1165 |
| 4-羥基-3-甲基苯甲醛 | NAD+ | 20.55 ± 1.91 | 0.10 ± 0.00 | 0.0049 ± 0.0005 |
據(jù)報(bào)道，PHBDD在對甲苯酚分解代謝中催化NADP+依賴的4-羥基苯甲醛氧化為4-羥基苯甲酸。本研究中，從200 ml培養(yǎng)物中純化得到總26 mg重組PHBDD，比活性為7.55 U mg-1。發(fā)現(xiàn)PHBDD能催化2,4-二甲苯分解代謝中4-羥基-3-甲基苯甲醛脫氫生成4-羥基-3-甲基苯甲酸，以NADP+或NAD+作為輔因子。動(dòng)力學(xué)測定顯示，PHBDD對4-羥基-3-甲基苯甲醛的Km值以NADP+（6.36±1.44μM）低于以NAD+（20.55±1.91μM）（表2）。就Kcat/Km效率而言，PHBDD對4-羥基-3-甲基苯甲醛以NADP+的效率比以NAD+高約三個(gè)數(shù)量級。因此，除了催化對甲苯酚分解代謝中4-羥基苯甲醛氧化外，PHBDD也催化2,4-二甲苯分解代謝中NADP+依賴的4-羥基-3-甲基苯甲醛氧化為4-羥基-3-甲基苯甲酸。另一方面，PHBDD對4-羥基苯甲醛（在對甲苯酚分解代謝中）的Km值（3.57±0.32μM）明顯低于對4-羥基-3-甲基苯甲醛（6.36±1.44μM）（在2,4-二甲苯分解代謝中），且其對4-羥基苯甲醛的催化效率比對4-羥基-3-甲基苯甲醛高六倍。
其他PHBDD可能參與2,4-二甲苯和對甲苯酚分解代謝
為檢驗(yàn)pchA編碼的PHBDD在2,4-二甲苯分解代謝中的作用，敲除并互補(bǔ)pchA。出乎意料地，菌株9866△pchA仍能在2,4-二甲苯和對甲苯酚以及其氧化產(chǎn)物相應(yīng)苯甲醛和苯甲酸上生長。此外，在菌株9866△pchA對2,4-二甲苯和對甲苯酚的生物轉(zhuǎn)化過程中，同時(shí)檢測到4-羥基-3-甲基苯甲酸和4-羥基苯甲酸。這暗示除pchA編碼的PHBDD外，存在其他具有PHBDD活性的酶。
| 生長碳源 | 菌株 | 調(diào)整后 R2 | μm (h?1) |
|---|---|---|---|
| 2,4-二甲苯 | 9866 | 0.9731 | 0.16 |
| 2,4-二甲苯 | 9866△pchA | 0.9650 | 0.06 |
| 4-羥基-3-甲基苯甲醛 | 9866 | 0.9014 | 0.06 |
| 4-羥基-3-甲基苯甲醛 | 9866△pchA | 0.9713 | 0.04 |
| 對甲苯酚 | 9866 | 0.9673 | 0.16 |
| 對甲苯酚 | 9866△pchA | 0.9647 | 0.09 |
| 4-羥基苯甲醛 | 9866 | 0.9557 | 0.32 |
| 4-羥基苯甲醛 | 9866△pchA | 0.9893 | 0.11 |
細(xì)菌生長實(shí)驗(yàn)也支持上述推論。菌株9866對所有測試底物的最大比生長速率（μm，每小時(shí)）高于菌株9866△pchA，如表3所示。這表明pchA缺失導(dǎo)致2,4-二甲苯、對甲苯酚、4-羥基-3-甲基苯甲醛和4-羥基苯甲醛的分解代謝速率下降。此外，菌株9866對4-羥基-3-甲基苯甲醛（6.05±0.05 U mg-1）和4-羥基苯甲醛（4.50±0.39 U mg-1）的比活性分別比菌株9866△pchA高60%。這些結(jié)果表明，盡管可能存在PHBDD同源物，pchA編碼的PHBDD在2,4-二甲苯和對甲苯酚分解代謝中起主要作用。
討論
先前，pchC和pchF編碼的PCMH和pchA編碼的PHBDD被報(bào)道負(fù)責(zé)對甲苯酚利用菌株9866中對甲基的氧化。本研究中，2,4-二甲苯誘導(dǎo)細(xì)胞中pchC、pchF和pchF的高轉(zhuǎn)錄表明PCMH和PHBDD可能也參與2,4-二甲苯的分解代謝。pchC和pchF被證明位于兩個(gè)不同操縱子上，且pchA和pchC在本研究中通過反轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)在同一操縱子上。pchAC和pchF之間的相對轉(zhuǎn)錄水平差異顯然是因?yàn)樗鼈兾挥诓煌倏v子且獨(dú)立轉(zhuǎn)錄。酶活性測定和中間體鑒定顯示，PCMH和PHBDD分別催化2,4-二甲苯氧化為4-羥基-3-甲基苯甲醛和4-羥基-3-甲基苯甲醛氧化為4-羥基-3-甲基苯甲酸。然而，先前報(bào)道中PCMH對對甲苯酚的Km值低于對2,4-二甲苯，且本研究中發(fā)現(xiàn)PHBDD對4-羥基苯甲醛的Km值也低于對4-羥基-3-甲基苯甲醛。這表明對甲苯酚和4-羥基苯甲醛在對甲苯酚分解代謝中可能分別是菌株9866中PCMH和PHBDD的生理底物。
另一方面，發(fā)現(xiàn)PCMH編碼基因?qū)?,4-二甲苯和對甲苯酚分解代謝是必需的，而PHBDD編碼基因?qū)Ψ纸獯x非必需。除pchA編碼的PHBDD外，對9866△pchA對不同中間體的最大比生長速率和比活性分析揭示可能存在其他具有PHBDD活性的酶。確實(shí)，幾個(gè)苯甲醛脫氫酶類似物被報(bào)道在 several 菌株中展示對4-羥基苯甲醛的活性，如惡臭假單胞菌質(zhì)粒pWW0上的xylC編碼的苯甲醛脫氫酶、乙酸鈣不動(dòng)桿菌的苯甲醛脫氫酶II和不動(dòng)桿菌屬菌株ADP1的areC編碼的苯甲醛脫氫酶，盡管這些酶未測試對4-羥基-3-甲基苯甲醛。
此外，PCMH和PHBDD編碼基因（pchC、pchF和pchA）本研究中也被顯示參與2,4-二甲苯的初始分解代謝，且位于菌株9866的質(zhì)粒pRA4000上，糾正了先前2,4-二甲苯利用結(jié)構(gòu)基因位于染色體上的結(jié)果。除PCMH和PHBDD外，也通過基因組步移和酶活性測定努力尋找負(fù)責(zé)2,4-二甲苯下游分解代謝途徑的其他基因和酶。然而，在質(zhì)粒pRA4000中未發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)2,4-二甲苯鄰甲基氧化和4-羥基異酞酸羥化酶的編碼基因。菌株9866中2,4-二甲苯利用結(jié)構(gòu)基因可能分布在質(zhì)粒和染色體上。
有趣的是，編碼推定轉(zhuǎn)座酶和解離酶的基因（tnpA和tnpR）被發(fā)現(xiàn)側(cè)翼PCMH和PHBDD編碼基因（pchC、pchF和pchA）及pRA4000中為原兒茶酸鄰位開環(huán)途徑識別的推定結(jié)構(gòu)基因（圖1b）。這暗示轉(zhuǎn)座可能在2,4-二甲苯和對甲苯酚分解代謝途徑的進(jìn)化中發(fā)生。此外，催化2,4-二甲苯鄰甲基初始羥化的4-羥基-3-甲基苯甲酸羥化酶被認(rèn)為是單加氧酶，與負(fù)責(zé)對甲基初始羥化的PCMH脫氫酶對比。有人提出vanillate脫甲基酶可能被招募并進(jìn)化為4-羥基-3-甲基苯甲酸羥化酶作為2,4-二甲苯途徑的一部分。這些推測與本研究結(jié)果一起表明，參與2,4-二甲苯分解代謝的酶基因可能從多種起源進(jìn)化而來。
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