酶活性測定和中間體鑒定
PCMH H6-PchF/PchC-H6對底物對甲苯酚和2,4-二甲苯的酶活性測定如前所述。對于H6-PchF/PchC-H6催化2,4-二甲苯反應產物的鑒定，設置1.5 ml反應混合物于50 mM甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0）中含0.33 mM 2,4-二甲苯、0.67 mM吩嗪硫酸甲酯、0.1 mM 2,6-二氯酚靛酚和147 μg H6-PchF/PchC-H6。從反應中取樣的樣品通過高效液相色譜-二極管陣列檢測器-質譜（HPLC-DAD/MS）分析。
HPLC-DAD/MS分析在Dionex UltiMate 3000 RS HPLC系統與自動進樣器和DAD檢測器，以及配備電噴霧電離源的LCQ FleetTM離子阱質譜儀上進行。色譜分離在Hypersil GOLD aQ柱（150×2.1 mm，3 μm粒徑）上使用梯度洗脫進行。二元流動相由溶劑A（水中0.1%乙酸）和B（乙腈）組成：0至0.5分鐘13% B；0.5至0.6分鐘增加至20% B，0.6至4.0分鐘增加至30% B，4.0至4.1分鐘增加至60% B，4.1至8.0分鐘保持60% B，然后0.1分鐘內回到13% B并平衡1.9分鐘；流速0.3 ml/min。柱溫和樣品盤維持在30°C。進樣體積15μl，DAD檢測波長范圍200-300 nm以監測紫外吸收。質譜儀在負離子模式和全掃描（50-300 m/z）下操作。樣品溶液使用氮氣作為鞘氣和輔助氣體，流速分別為35和5 arb（1 arb=0.3 l/min），進行霧化和蒸發。離子噴霧電壓和傳輸毛細管電壓分別設為5.0 kV和-45 V。傳輸毛細管溫度維持在300°C。
PHBDD PchA-H6對底物4-羥基苯甲醛和4-羥基-3-甲基苯甲醛在輔因子NAD+或NADP+（鈉鹽）存在下的酶活性測定如前所述修改進行。反應混合物（最終體積1.0 ml）含40 mM HEPES-KOH緩沖液（pH 8.0）、50 μM NAD+或NADP+、50 μM 4-羥基苯甲醛或4-羥基-3-甲基苯甲醛和1.3μg酶（NADP+為輔因子）或104 μg酶（NAD+為輔因子）。參考比色杯含所有這些化合物 except 底物， assay 通過添加底物啟動。PchA-H6催化4-羥基苯甲醛和4-羥基-3-甲基苯甲醛轉化過程中340 nm的分光光度變化通過Lambda 25 UV/VIS光譜儀監測。底物和產物通過HPLC-DAD/MS與標準的保留時間、紫外光譜和質譜比較確認。對于HPLC-DAD/MS分析，反應混合物體積擴大至20 ml。
在PHBDD動力學測定中，進行四組獨立實驗，底物濃度范圍從2到80 μM，輔因子濃度固定為100 μM。數據通過OriginPro 8軟件用米氏方程擬合。蛋白質濃度通過Bradford法以牛血清白蛋白為標準測定。一單位酶活性定義為30°C下每分鐘催化還原1 μmol NADP+或NAD+的酶量。比活性表示為每毫克蛋白質的單位。
基因敲除和互補
用于基因敲除的pEX18Tc-pchA和pEX18Tc-pchF通過將卡那霉素抗性基因和靶基因上下游兩個片段的PCR產物與SacI/HindIII消化的pEX18Tc融合，使用In-Fusion® HD克隆試劑盒構建。這兩個所得質粒轉化到大腸桿菌WM3064（2,6-二氨基庚二酸營養缺陷型）后，通過接合轉移到菌株9866。9866△pchA和9866△pchF的雙交換重組子在含10%蔗糖（w/v）、氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上篩選。
用于基因互補的pRK415-pchA和pRK415-pchF通過將pchA和pchF的PCR產物與HindIII和EcoRI消化的pRK415融合構建。它們轉化到大腸桿菌WM3064后，通過接合到pchA和pchF缺失菌株9866中獲得9866△pchA[pRK415-pchA]和9866△pchF[pRK415-pchF]。
細菌生長測量
菌株9866及其衍生物以1.0 mM各碳源生長的OD600在自動濁度計Bioscreen C中測量。獲取的數據轉換為相應的細胞干重生物量。然后，生長曲線通過修改的Gompertz方程用OriginPro 8軟件擬合，并計算其最大比生長速率（μm，每小時）。
菌株9866及其突變體對不同底物的生物轉化
菌株9866及其突變體在2 mM葡萄糖中培養至OD600為0.1，然后用2 mM 2,4-二甲苯和對甲苯酚誘導5小時，之后進行4-羥基-3-甲基苯甲醛和4-羥基苯甲醛的生物轉化。細胞通過4,500×g離心1.0分鐘收獲，洗滌兩次，用最小培養基稀釋至OD600為0.3，然后不同底物添加到每10 ml懸浮細胞中至終濃度1 mM。每10分鐘從每個反應取0.5 ml樣品，與0.5 ml乙腈混合，劇烈渦旋3分鐘以停止反應。樣品然后在14,500×g離心10分鐘，收集上清液進行定量分析。
分析在Agilent 1200 HPLC系統上進行，配備可變波長檢測器和Agilent ZORBAX 300SB-C18柱（250×4.6 mm，5μm粒徑）。流動相由溶劑A（水中0.1%乙酸）和B（乙腈）組成。梯度程序從10% B開始，0至11分鐘增加至30% B，11至16分鐘增加至70% B，16至17分鐘保持70% B，然后0.1分鐘內回到10% B并平衡2.9分鐘。流速1.0 ml/min。柱溫30°C。進樣體積20μl，檢測波長250 nm。在此條件下，4-羥基-3-甲基苯甲醛、4-羥基-3-甲基苯甲酸、4-羥基苯甲醛和4-羥基苯甲酸的保留時間分別為11.0、8.7、7.4和5.9分鐘。一單位活性定義為30°C下每分鐘轉化1 μmol底物所需的細胞量（毫克細胞干重）。
基因組步移
基因組步移進行以克隆質粒pRA4000中5,276-bp DNA序列側翼區域，方法如前所述。本研究獲得的核苷酸序列GenBank登錄號為KC762703。