摘要 惡臭假單胞菌NCIMB 9866利用對甲苯酚或2,4-二甲苯作為唯一碳源和能源。催化對甲苯酚對甲基氧化的酶已被詳細研究，但負責2,4-二甲苯分解代謝中對甲基氧化的酶尚未報道。本研究通過實時定量PCR分析表明，對甲苯酚分解代謝中編碼對甲苯酚甲基羥化酶（PCMH）的pchC和pchF基因以及編碼對羥基苯甲醛脫氫酶（PHBDD）的pchA基因可能也參與2,4-二甲苯的分解代謝。酶活性測定和中間體鑒定表明，PCMH和PHBDD分別催化2,4-二甲苯氧化為4-羥基-3-甲基苯甲醛和4-羥基-3-甲基苯甲醛氧化為4-羥基-3-甲基苯甲酸。此外，通過基因敲除和互補實驗發現，編碼PCMH的基因pchF對2,4-二甲苯分解代謝是必需的，而編碼PHBDD的基因pchA不是分解代謝所必需的。對基因敲除菌株對不同中間體的最大比生長速率和比活性分析表明，菌株9866中存在其他具有PHBDD活性的酶，但PHBDD在2,4-二甲苯分解代謝中起主要作用。
引言
2,4-二甲苯，也稱為2,4-二甲基苯酚，是煤氣工業的副產品。由于其環境毒性，它被美國環境保護署列入優先污染物清單。至今，兩種細菌菌株，惡臭假單胞菌NCIMB 9866和副球菌屬菌株U120，被報道能完全降解這種環境污染物。在惡臭假單胞菌NCIMB 9866中，2,4-二甲苯分解代謝起始于對甲基氧化為羧基，通過兩個推定中間體4-羥基-3-甲基芐醇和4-羥基-3-甲基苯甲醛形成4-羥基-3-甲基苯甲酸；隨后4-羥基-3-甲基苯甲酸中的鄰甲基也被氧化為羧基，通過其相應的醇和醛中間體，產生4-羥基異酞酸；4-羥基異酞酸轉化為原兒茶酸（PCA），進入鄰位開環途徑進行進一步代謝（圖1a）。該菌株中參與2,4-二甲苯分解代謝的兩種酶，4-羥基-3-甲基苯甲酸羥化酶和4-羥基異酞酸羥化酶，已被純化和表征；但其編碼基因尚未報道。
圖1 a 惡臭假單胞菌NCIMB 9866中2,4-二甲酚和對甲酚的推定代謝途徑（Chapman和Hopper 1968；Cronin等1999；El-Mansi和Hopper 1990；Elmorsi和Hopper 1977；Kim等1994），以及本研究提出的由pchC和pchF編碼的PCMH及pchA編碼的對羥基苯甲醛脫氫酶（PHBDD）催化的代謝反應（標有星號）。b 通過從已報道基因雙向基因組步移獲得的基因簇結構
菌株9866也利用對甲苯酚，其分解代謝同樣起始于對甲基氧化為羧基，通過兩個中間體4-羥基芐醇和4-羥基苯甲醛形成4-羥基苯甲酸，最終在4-羥基苯甲酸直接轉化為PCA后進入PCA的鄰位開環途徑（圖1a）。來自85-kb質粒pRA4000的一個5,276-bp DNA序列攜帶pchA、pchC和pchF基因已被測定（圖1b）。純化的pchC和pchF編碼的PCMH被證明催化對甲苯酚的兩個脫氫反應生成相應的醇和醛。pchA編碼的PHBDD被證實催化NADP+依賴的4-羥基苯甲醛氧化為4-羥基苯甲酸。盡管PCMH也被顯示對2,4-二甲苯有催化活性，但其可能產物未被鑒定，且其在2,4-二甲苯分解代謝中的生理作用未在體內驗證。因此，探究負責對甲苯酚初始氧化的酶是否也參與2,4-二甲苯氧化將是有趣的。此外，尚未有酶被報道負責2,4-二甲苯初始氧化中4-羥基-3-甲基苯甲醛氧化為4-羥基-3-甲基苯甲酸。本研究中，我們報道菌株9866中2,4-二甲苯和對甲苯酚的分解代謝在對甲基氧化中共享相同的酶。
材料與方法
細菌菌株、質粒、引物、化學品、培養基和培養條件
使用的細菌菌株和質粒見表1，引物見表S1。假單胞菌菌株在30°C于最小培養基中與不同碳源一起培養。大腸桿菌菌株在37°C于溶菌肉湯（LB）中培養。抗生素在必要時以100μg/ml氨芐青霉素鈉、50μg/ml硫酸卡那霉素或20μg/ml鹽酸四環素的濃度添加到培養基中。所有試劑購自Sigma Chemical Co.或Fluka Chemical Co.。
| 菌株或質粒 | 特性或目的 | 參考文獻或來源 |
|---|---|---|
| 惡臭假單胞菌NCIMB 9866 | 野生型菌株，表型為2,4-二甲苯+和對甲苯酚+, AmpR, KanS, TcS | Chapman and Hopper (1968) |
| 9866△pchA | NCIMB 9866突變體，pchA基因被來自質粒pTnMod-Okm的卡那霉素抗性基因替換, AmpR, KanR | 本研究 |
| 9866△pchA[pRK415-pchA] | pchA基因通過pRK415-pchA在9866△pchA中互補, AmpR, KanR, TcR | 本研究 |
| 9866△pchF | NCIMB 9866突變體，pchF基因被來自質粒pTnMod-Okm的卡那霉素抗性基因替換, AmpR, KanR | 本研究 |
| 9866△pchF[pRK415-pchF] | pchF基因通過pRK415-pchF在9866△pchF中互補, AmpR, KanR, TcR | 本研究 |
| 大腸桿菌DH5a | F- φ80(lacZ)△M15 △lacX74 hsdR(rK- mK+) △recA1398 endA1 tonA | TransGen Biotech |
| 大腸桿菌BL21(DE3) | F- ompT hsdS(rB- mB-) gal dcm (DE3) | TransGen Biotech |
| 大腸桿菌WM3064 | 接合供體菌株，2,6-二氨基庚二酸營養缺陷型: thrB1004 pro thi rpsL hsdS lacZ△M15 RP4-1360 △(araBAD)567 △dapA1341::[erm pir(wt)] | Dehio and Meyer (1997), Saltikov and Newman (2003) |
| pET-28a(+) | 表達載體, KanR, C/N端His·Tag/凝血酶/T7·Tag, T7 lac啟動子, T7轉錄起始, fl起源, lacI | Novagen |
| pEX18Tc | 基因敲除載體, oriT+, sacB+, TcR | Hoang et al. (1998) |
| pRK415 | 廣宿主范圍載體, TcR | Keen et al. (1988) |
| pTnMod-Okm | 卡那霉素抗性基因來源 | Dennis and Zylstra (1998) |
| pET-28a(+)-pchA | PHBDD表達載體，通過將pchA插入NcoI/HindIII限制位點，帶有C端His·Tag | 本研究 |
| pET-28a(+)-pchFC | PCMH表達載體，通過克隆pchF和pchC到Ndel/HindIII限制位點，帶有C端和N端His-Tag | 本研究 |
| pEX18Tc-pchA | pchA基因敲除載體，包含pchA上游和下游區域同源DNA片段及來自pTnMod-Okm的卡那霉素抗性基因 | 本研究 |
| pEX18Tc-pchF | pchF基因敲除載體，包含pchF上游和下游區域同源DNA片段及來自pTnMod-Okm的卡那霉素抗性基因 | 本研究 |
| pRK415-pchA | pchA基因互補載體，通過將pchA融合到pRK415的HindIII/EcoRI限制位點 | 本研究 |
| pRK415-pchF | pchF基因互補載體，通過將pchF融合到pRK415的HindIII/EcoRI限制位點 | 本研究 |
實時定量PCR
菌株9866在以2 mM葡萄糖為碳源的最小培養基中培養至OD600為0.1，然后用2 mM 2,4-二甲苯或對甲苯酚誘導5小時。總RNA使用RNAprep pure細菌試劑盒分離，并使用PrimeScript RT試劑盒與gDNA Eraser反轉錄為cDNA。實時定量PCR在CFX ConnectTM實時PCR檢測系統上使用iQ SYBR Green Supermix與表S1中的引物進行。目標mRNA的量通過2?ΔΔCT方法相對于16S rRNA進行標準化。
基因克隆與表達、蛋白質純化
從菌株9866基因組DNA PCR擴增的pchA經NcoI和HindIII消化后克隆到pET-28a(+)中，獲得表達構建體pET-28a(+)-pchA；pchF和pchC擴增后與pET-28a(+)的Ndel/HindIII限制位點融合，使用NovoRec® PCR一步定向克隆試劑盒產生構建體pET-28a(+)-pchFC。
攜帶表達構建體的大腸桿菌BL21(DE3)菌株在37°C培養至OD600為0.5，然后在30°C用0.1 mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導5小時。C端His標記的PchA（PchA-H6）和N端His標記的PchF（H6-PchF）/C端His標記的PchC（PchC-H6）從相應細胞提取物中通過Ni2+-NTA瓊脂糖色譜法純化。結合柱的蛋白質用結合緩沖液（PchA-H6為40 mM HEPES-KOH緩沖液pH 8.0，H6-PchF/PchC-H6為50 mM甘氨酸-NaOH緩沖液pH 9.0）含50和250 mM咪唑洗滌和洗脫。純化的蛋白質對結合緩沖液透析，通過SDS-PAGE分析，然后儲存于4°C。
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