陰性對照處理包括J2爪哇根結線蟲僅與GMM一起孵育。包括一個陽性對照處理，由化學殺線蟲劑Vydate P（100 mg/l）組成。用Parafilm密封管子，并在25°C黑暗條件下孵育24小時。通過40倍放大鏡觀察測定存活J2線蟲的濃度作為毒性指標。根據不動性和存在僵直身體來判斷死亡個體。處理包括三個重復管，采用完全隨機設計。進行了兩個獨立試驗。
在按如下方法制備的線蟲生長培養基上維持秀麗隱桿線蟲SS104：將3克NaCl、17克瓊脂和2.5克蛋白胨加入975毫升蒸餾水中。將溶液高壓滅菌，然后冷卻至55°C。加入1毫升1M CaCl2、1毫升5毫克/毫升膽固醇（溶于乙醇制備）、1毫升1M MgSO4和25毫升1M KPO緩沖液（108.3克KH2PO4，25.6克K2HPO4，加水至1升，pH 6.0）。使用大腸桿菌OP50作為食物來源。菌株SS104是一種溫度敏感型突變體，在25°C孵育時無法繁殖，這確保了測定期間線蟲數量恒定。在實驗前，通過漂白程序同步線蟲的年齡分布。簡而言之，用5毫升無菌M9緩沖液洗滌含有卵的瓊脂平板表面，以1500 xg離心2分鐘，將沉淀重懸于4.5毫升漂白溶液（0.5毫升水，2.5毫升1M氫氧化鈉，和4毫升約4%次氯酸鈉）中。將管子間歇性輕輕混合約5分鐘，以殺死除卵以外的所有線蟲形態。通過以1500 xg離心1分鐘停止反應。用M9緩沖液洗滌沉淀三次，重懸，然后在25°C下輕輕攪動孵育14小時。將同步化的線蟲（L1幼蟲階段）置于鋪有大腸桿菌OP50的NGM瓊脂平板上，在25°C孵育2天以獲得L4成蟲階段線蟲，按上述方法從瓊脂平板中回收。
將泛菌屬菌株、大腸桿菌OP50和用作此試驗陽性對照的腸道沙門氏菌CECT 4595的細菌細胞懸浮液鋪在NGM上，并在適當溫度下生長24小時。對于存活測定，將收集的蠕蟲轉移到細菌（處理）的新鮮菌苔平板上（每平板150條）。每個測定進行三次重復。對于使用細菌菌株無細胞培養上清液的測定，將培養物在LB肉湯中于28°C生長48小時，腸道沙門氏菌CECT 4594除外，其在37°C孵育。
將培養物以10,000 xg離心10分鐘，上清液通過0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。將400μl濾液分裝到24孔板中，每孔含有50μl大腸桿菌OP50在M9緩沖液中的懸浮液和50μl同步化的L4線蟲（約100條個體）。通過40倍放大鏡觀察，在7天（細菌細胞懸浮液）或5天（無細胞培養上清液）內對蠕蟲死亡率進行評分。根據不動性和存在僵直身體來判斷死亡個體。該測定進行三次重復。使用750μM疊氮化鈉作為陽性對照。
溶血活性。 在固體和液體培養基中評估溶血活性。使用化膿性鏈球菌ATCC 19615和蜂毒肽作為陽性對照。在固體培養基中，通過在含有5%（v/v）綿羊或馬紅細胞的血瓊脂基礎培養基上以適當稀釋度一式三份鋪板細菌菌落，在28°C孵育48小時后，通過菌落周圍是否存在透明暈圈來評定溶血活性。在液體培養基中，使用懸浮于林格氏液中的細胞和從LB肉湯中培養48小時后獲得的無細胞培養上清液。通過測定從綿羊或馬血（5% v/v）的紅細胞懸浮液中釋放的血紅蛋白來評估溶血作用。
將血液以6000 xg離心5分鐘，用Tris緩沖液（10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.2）洗滌三次，并稀釋十倍。將等分紅細胞（65μl）與65μl細菌細胞懸浮液（5 x 10^8 CFU/ml）或無細胞培養上清液在三份中于96孔反應板中混合，并在37°C連續振蕩孵育1小時。孵育后，將管子以3500 xg離心10分鐘。將等分上清液（80μl）轉移至100孔微孔板中，并用80μl去離子水稀釋。使用Bioscreen C生長曲線分析儀在540 nm波長下測量吸光度作為溶血指標。在添加了蜂毒肽（100μM）作為陽性對照的Tris緩沖液中測定完全溶血。
遺傳毒性。 在艾姆斯試驗之前，對培養上清液進行測定以確保其對沙門氏菌菌株無細胞毒性（存活率高于50%）。按照OECD測試指南471中的描述進行細菌回復突變試驗（艾姆斯試驗），使用兩種沙門氏菌鼠傷寒血清型參考菌株（TA98，用于檢測移碼突變；TA100，用于檢測堿基對置換），無需代謝活化。按上述溶血活性測試方法制備泛菌屬無細胞培養上清液。制備兩種沙門氏菌菌株的過夜LB肉湯培養物。通過將0.1 ml泛菌屬無細胞上清液與3 ml頂層瓊脂、0.2 ml組氨酸-生物素溶液（0.5 mM）和0.2 ml濃度為5 x 10^8 CFU/ml的沙門氏菌懸浮液混合，并在基本培養基上鋪板來進行遺傳毒性測定。使用1.25和2.5μM疊氮化鈉作為TA100菌株的誘變劑，使用2.5和5.0μM 2-硝基芴作為TA98菌株的誘變劑。測定進行三次重復。當誘導回復突變體數與自然回復突變體數之比≥2時，判定遺傳毒性為陽性。
統計分析。 使用單因素方差分析確定處理效應的顯著性。使用P < 0.05水平的Waller-Duncan檢驗進行均值分離。使用PC-SAS的GLM程序進行分析。
結果與討論
最近的基因型和生化分析對泛藻凝集菌生物防治菌株和臨床菌株的區分有限，而本文我們使用表型比較獲得了更大程度的區分。因此，可以基于對植物病原菌的拮抗活性清楚地區分植物有益菌株和臨床菌株。我們沒有發現任何生物防治菌株有毒性的證據，但使用線蟲模型發現兩種臨床菌株有致病性的證據。這些發現支持了先前報道的臨床和生物防治菌株中缺乏遺傳毒力決定因子。
所有七種植物有益菌株在針對常見植物病原菌擴展青霉和解淀粉歐文氏菌的測定中，均顯著抑制了至少一種植物病害，其中三種菌株在兩種測定中均顯示出顯著的生物防治活性。只有兩種植物有益菌株（Eh318和Eh1087），它們最初是作為火疫病生物防治劑被篩選出來的，未能抑制真菌病原菌擴展青霉（圖1）。
圖1. 泛菌屬臨床菌株（黑柱）和植物益生菌株（白柱）對'金冠'蘋果由擴展青霉引起的青霉病的生物防治效果。數值為三次重復的平均值，每次重復包含三個果實，每個果實有三個創口。誤差線表示平均值的95%置信區間。根據Waller-Duncan檢驗，標有相同字母的青霉病腐爛率柱狀圖無顯著差異（P<0.05）。
類似地，只有兩種最初是作為采后腐爛病生物防治劑篩選出來的菌株（CPA-2和EPS125）未能抑制花朵中的細菌病原菌解淀粉歐文氏菌（圖2），而所有火疫病生物防治劑都是有效的。觀察到的生物防治菌株的抑制活性并不令人驚訝，因為它們先前是在針對特定目標病原菌的大量環境分離株篩選中基于其優異的生物防治活性而被篩選出來的。相比之下，六種臨床泛菌屬菌株在采后測定或花朵測定中通常無效或僅有微弱效果。六種臨床菌株中有四種抑制了解淀粉歐行氏菌在花朵中的感染，盡管通常程度低于生物防治菌株（圖2）。
圖2. 成團泛菌臨床菌株（黑色柱）與植物益生菌株（白色柱）對梨火疫病的生物防治效果。數據為八個花朵三次重復的平均值。誤差線表示均值的95%置信區間。根據Waller-Duncan檢驗，標有相同字母的火疫病嚴重程度柱狀圖差異不顯著（P<0.05）。
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