結果與討論
豬鏈球菌BirA蛋白是II組BPL成員
豬鏈球菌似乎是生物素營養缺陷型，因為它缺乏生物素合成，并依賴于BioY-BirA機制從棲息地和/或感染宿主環境中清除生物素（圖1）。Rodionov等人的系統生物學表明，以大腸桿菌BirA為例的雙功能BPL酶（II組）在真細菌和古細菌中普遍存在，暗示II組形式可能是BPL的祖先。與缺乏DNA結合結構域的I組BPL（例如，農桿菌和布魯氏菌的BirA直系同源物）不同，多序列比對分析表明豬鏈球菌BirA與范例大腸桿菌birA產物大致相似（圖2）。然而，在豬鏈球菌的近親乳酸乳球菌中，情況似乎不尋常，因為這種益生菌含有兩個版本的BPL，其中一個是指BirA1_LL（II組BPL），另一個是缺乏DNA相互作用基序的BirA2_LL（I組BPL）（圖2）。
為了解決豬鏈球菌BirA的BPL生物化學問題，我們應用蛋白質工程來生產重組蛋白。正如預期，我們收獲了質量約為37 kDa的BirA_ss蛋白（圖3A）。此外，通過SDS-PAGE判斷純度（圖3A）。為了進一步確認身份，將重組BirA蛋白消化的多肽片段進行MALDI-TOFF分析。MS結果表明重組蛋白與豬鏈球菌BirA的天然形式匹配良好，顯示出54%的覆蓋率（圖3B）。結構建模將豬鏈球菌BirA指定為具有完美結構的典型II組BPL版本（圖3C）。它包括以下三個功能基序：N端DNA結合結構域、中央結構域和C端結構域（圖3C）。顯然，上述數據將豬鏈球菌BirA定義為II組BPL成員。
圖1. 豬鏈球菌中生物素轉運和利用的當前模型。生物素轉運蛋白BioY用建模的帶狀結構（紫色）說明，并整合到細菌膜方案中。從環境轉運的生物素被激活成生物素酰-5'-AMP，然后轉移到BCCP受體蛋白，產生生物素酰-5'-BCCP。硫標記為橙色，AMP（和/或ATP/PPi）突出顯示為紅色。生物素受體蛋白BCCP用藍色矩形表示。
圖2. 豬鏈球菌BirA直系同源物與原型大腸桿菌版本的序列比較。使用Clustal Omega程序（ClustalW2的更新版本）進行BirA蛋白的多序列比對，最終輸出通過ESPript 3.0程序給出。相同殘基為紅底白字，相似殘基為白底紅字，變異殘基為灰字，缺口用點表示。蛋白質二級結構以卡通形式顯示（頂部），α：α-螺旋；β：β-折疊；T：轉角；n：卷曲。
圖3. 豬鏈球菌BirA蛋白的表征。（A）來自豬鏈球菌的重組BirA蛋白純化的SDS-PAGE圖譜。應用梯度SDS-PAGE（4-20%）分離蛋白質。（B）基于MS的豬鏈球菌BirA重組蛋白測定。與豬鏈球菌BirA天然形式匹配的肽片段用粗體和下劃線字母（紅色）給出。總共檢測到54%的覆蓋率。（C）豬鏈球菌BirA蛋白的建模帶狀結構。豬鏈球菌BirA蛋白包括三個結構域：N端DNA結合結構域（紫色），中央結構域（藍色），和具有酶活性的C端結構域（黃色）。
豬鏈球菌BirA的生物素蛋白連接酶活性
我們采用體外和體內方法來解決豬鏈球菌BirA的BPL活性。用于功能互補的兩個大腸桿菌birA突變體包括birAts溫度敏感突變體（BM4062）和birA1 Km突變體（BM4092）。正如預期，帶有/不帶有空載體pBAD24的BM4062菌株在42°C的非允許溫度下不能在M9瓊脂平板上生長（圖4A）。相反，質粒攜帶的birA_ss的阿拉伯糖誘導表達（甚至基礎表達）支持birAts突變體BM4062在42°C下生長（圖4A）。BM4062菌株在液體培養基中的生長曲線測量也再現了與瓊脂平板獲得的結果相似的結果（圖4B）。pBAD24質粒攜帶的birA_ss的存在允許大腸桿菌birA1 Km突變體BM4092在補充低水平生物素（25 nM）的最小培養基上生長（圖4C），這與生長曲線中看到的情況非常一致（圖4D）。顯然，它證實了豬鏈球菌BirA在替代模型大腸桿菌中具有BPL連接酶的作用。
為了進一步證明豬鏈球菌BirA的BPL功能，我們建立了體外酶反應分析。在這個BirA催化的反應系統中，使用的底物是AccB蛋白的生物素化結構域（指定為AccB87或BCCP87）（圖5A，B），它在122位賴氨酸（K122）攜帶一個保守的生物素化位點（圖5A，C）。應用薄層色譜法測定α-32P標記的ATP和生物素向生物素酰-AMP的轉化（圖5D）。原則上，它代表了第一個連接酶部分反應的直接證據（圖5D），并且在添加受體蛋白AccB87后提供了第二個連接酶部分反應（即將生物素從生物素酰-5'-AMP轉移到AccB87受體蛋白）的間接證明（圖5D）。正如預期，豬鏈球菌BirA蛋白顯示將生物素和[α-32P]-ATP轉化為規范的生物素酰-5'-AMP中間體（圖5D），并將生物素部分轉移到AccB-87受體蛋白（圖5D）。
隨后，我們利用基質輔助激光解吸/電離來測量BirA連接酶催化的AccB-87生物素化水平，如我們最近所述。MS結果說明AccB87的計算質量為10324.2~10327.5（圖6A），而生物素酰-AccB87的預期質量為10550.6（圖6B）。總之，綜合數據表明豬鏈球菌BirA作為BPL家族的功能成員起作用。
圖4. 用推定的生物素蛋白連接酶編碼基因birA對大腸桿菌birA突變體進行功能互補。（A）攜帶質粒攜帶的豬鏈球菌birA基因的大腸桿菌BM4062 birAts突變體在M9瓊脂平板上的生長。（B）大腸桿菌BM4062 birAts突變體及其衍生物的生長曲線。大腸桿菌菌株在42°C（BM4062的非允許溫度）下在確定的M9培養基（有/無0.2%阿拉伯糖）中維持約36小時。M9瓊脂平板補充有0.5 mM X-gal加100nM生物素。（C）攜帶質粒攜帶的豬鏈球菌birA的大腸桿菌BM4092 birA1 Km突變體在M9瓊脂平板上的生長。（D）大腸桿菌BM4092 birA1Km突變體及其衍生物的生長曲線。大腸桿菌菌株在30°C下在確定的M9培養基（有/無0.2%阿拉伯糖）中維持約36小時。M9瓊脂平板補充有0.5 mM X-gal加25 nM生物素。細菌生長通過600 nm的光密度測量，使用BioScreen C微生物生長曲線分析儀自動記錄。每個生長曲線分析進行三次，平均值用于此圖。指定：Vec，載體（對照）；ts：溫度敏感；Ara，阿拉伯糖。
圖5. 豬鏈球菌BirA生物素化AccB底物蛋白的證據。（A）BCCP受體蛋白（也稱為AccB）的生物素化結構域的序列分析。（B）生物素底物結構域（BCCP87或AccB87）的SDS-PAGE圖譜。（C）豬鏈球菌AccB蛋白生物素化結構域的結構建模。AccB的生物素化位點是122位的賴氨酸（K122）。（D）豬鏈球菌BirA的BPL酶活性TLC分析。縮寫：M，蛋白質標記（Biorad）；kDa，千道爾頓。加號（+）和減號（-）表示存在和不存在BirA蛋白、生物素或AccB87底物蛋白。
圖6. 基于MS驗證豬鏈球菌BirA催化的AccB87底物蛋白的生物素化。（A）未生物素化AccB87多肽分子量的MALDI-TOF測定。（B）通過豬鏈球菌BirA對AccB87底物進行生物素化的MALDI-TOF鑒定。AccB87的計算質量為10324.2~10327.5，豬鏈球菌BirA生物素酰-AccB87的預期質量（圖B）為10550.6。指定：減號表示未添加BirA酶，加號表示添加BirA蛋白。
相關新聞推薦
1、貓皰疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株一步生長曲線及生物學特性研究——結果與分析、討論
2、豆科作物根瘤菌噬菌體形態結構、生長曲線及生物學特性（二）
3、動物雙歧桿菌NX-6生長曲線測定、斑馬魚降脂功效實驗及促進脂肪代謝機制研究（一）