方法


細菌菌株和生長條件。 這里使用的細菌菌株包括大腸桿菌和豬鏈球菌（表1），所有大腸桿菌菌株均源自野生型K-12（表1）。兩種培養基（Luria Bertani（LB）和豐富肉湯（RB））用于大腸桿菌，而Todd Hewitt Broth（THB）培養基用于豬鏈球菌?？股匮a充如下（mg/升）：氨芐青霉素鈉，100；硫酸卡那霉素，50；和壯觀霉素，100。


表1. 本研究中使用的細菌和質粒。

菌株或質粒 相關特征 來源
菌株
Topolo 大腸桿菌的克隆宿主 Invitrogen
BL21(DE3) 大腸桿菌的表達宿主 實驗室庫存
BM4092 大腸桿菌的birA km突變體 4
BM4062 大腸桿菌的birAts溫度敏感突變體 4
FYJ277 攜帶pET28a-birA_ss的Topo 10 本工作
FYJ278 攜帶pBAD24-birA_ss的Topo 10 本工作
FYJ279 攜帶pET28b-LLbccp87的BL21 本工作
FYJ280 攜帶pET28a-birA_ss的BL21 本工作
05ZYH33 中國強毒SS2的流行菌株 實驗室庫存
birA(△N) 05ZYH33的birA突變體，缺乏N端DNA結合結構域 本工作
質粒
pSET4s 熱敏自殺載體，SpcR 45
pET28a(+) 用于在大腸桿菌中生產重組蛋白的T7啟動子驅動表達載體 Novagen
pBAD24 阿拉伯糖誘導型表達載體 51
pET28a-birA_ss 攜帶豬鏈球菌birA基因的pET28a 本工作
pBAD24-birA_ss 編碼豬鏈球菌birA基因的pBAD24衍生物 本工作
pSET4s-UD 用于框內刪除豬鏈球菌birA N端結構域的pSET4s衍生物 本工作

質粒和遺傳操作。 使用豬鏈球菌05ZYH33的基因組DNA作為模板，通過PCR擴增birA基因（SSU05_1625），并克隆到表達載體pET28（a）中，得到重組質粒pET28-birA_ss（表1）。為了制備BirA蛋白，將表達質粒pET28-birA_ss轉化到菌株BL21（DE3）中，得到菌株FYJ280（表1）。


此外，將birA_ss基因克隆到阿拉伯糖誘導型表達載體pBAD24中，得到質粒pBAD24-birA_ss。為了評估BirA的體內活性，應用了兩個大腸桿菌birA突變體，分別稱為birA km突變體菌株BM4092和溫度敏感突變體BM4062（表1）。鑒于birA是一個雙功能基因且為細菌存活所必需，在5'端刪除birA的部分功能是合理的。因此，我們采用同源重組方法從豬鏈球菌05ZYH33的birA基因中去除N端DNA結合結構域，得到突變體birA（△N）（表1）。在這種情況下，應用了熱敏自殺載體pSET4s。將豬鏈球菌bioY的啟動子融合到無啟動子的lacZ基因上，創建質粒攜帶的PbioY-lacZ融合（表1）。為了檢查birA的體內作用，將PbioY-lacZ融合分別引入野生型菌株和豬鏈球菌的birA（△N）突變體中。所有獲得的質粒均通過PCR分析和直接DNA測序驗證。


BirA蛋白的表達和純化。 使用攜帶28-birAss的大腸桿菌制備豬鏈球菌BirA的重組蛋白。用0.5mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）在30°C下誘導細菌培養物3小時。將澄清的細菌上清液上樣到鎳親和柱（Qiagen）上。用含有150 mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫6x His標簽的靶蛋白，并通過SDS-PAGE判斷純度。


液相色譜四極桿飛行時間質譜。 應用Waters Q-Tof API-US Quad-ToF質譜儀測定豬鏈球菌BirA（BirA_ss）蛋白的身份。將純化的蛋白質條帶從凝膠上切下，并用胰蛋白酶（G-Biosciences St. Louis, MO）消化，得到一組重疊肽，上樣到Waters Atlantis C-18柱（0.03 mm顆粒，0.075 mm x 150 mm）上。獲得的數據進行ms/ms分析。


體外Bio-5'-AMP合成和薄層色譜。 建立體外分析以測定BirA連接酶的蛋白質生物素化活性，如我們先前所述，略有修改。酶反應系統包括50 mM Tris-HCl（pH 8），5 mM三（2-羧乙基）膦，5mM MgCl2，20μM生物素，5μM ATP加16.5nM[α-32P]ATP，100mM KCl和2μM連接酶蛋白。將反應混合物在37°C下保持30分鐘。為了弄清楚BirA連接酶的作用，平行保持兩個反應管，其中一個補充AccB-87（50μM）。隨后，將每個反應混合物的1μl點樣到微晶纖維素纖維素薄層色譜板上，并在異丁酸-NH4OH-水（66:1:33體積比）中展開。將薄層色譜圖干燥過夜，暴露于磷光成像板，并使用Fujifilm FLA-3000磷光成像儀可視化。


基于MALDI的BirA生物素化活性測定。 BirA催化的生物素化反應包括以下組分（100μM AccB-87，3μM連接酶，100μM生物素，1mM ATP，10mM MgCl2，100mM KCl，5mM三（2-羧乙基）膦，在50mM Tris-HCl（pH 8.0）中）。將反應在37°C下保持16小時，然后對25 mM乙酸銨透析，凍干至干燥。隨后，使用基質輔助激光解吸/電離方法測定上述樣品中AccB87的生物素化形式。


電泳遷移率變動分析。 進行凝膠變動實驗以測試BirA蛋白與不同來源的bioY啟動子的相互作用。通過退火兩個互補寡核苷酸制備三組DNA探針（bioY_SS，bioY_LL和bioY_EF）（表2）。在EMSA試驗中，將地高辛標記的DNA探針（~0.2 pmol）在結合緩沖液（Roche）中與純化的BirA_ss蛋白孵育。必要時，補充生物素酰-5'-AMP配體。將DNA/蛋白質混合物用天然7% PAGE分離，并通過直接接觸凝膠轉移將膜轉移到尼龍膜上，通過膜暴露于ECL膠片（Amersham）獲得化學發光信號。


β-半乳糖苷酶分析。 將攜帶lacZ融合的豬鏈球菌的過夜培養物在THB培養基中生長，進行β-半乳糖苷酶活性的直接測量。必要時，添加血液血清以增強突變豬鏈球菌的細菌生長。使用French壓力機制備細菌裂解物。數據記錄三次以上三個獨立分析。


生物信息學分析。 BirA蛋白的直系同源物分別來自大腸桿菌、乳酸乳球菌和豬鏈球菌05ZYH33。BirA結合位點從RegPrecise數據庫收集。使用ClustalW2程序進行蛋白質（和/或DNA）的多重比對，最終輸出通過ESPript 2.2程序給出。使用中性網絡啟動子預測服務器預測轉錄起始位點。使用CPHmodels 3.2服務器進行結構建模。



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