摘要
生物素蛋白連接酶在生命三域中普遍存在。BPL的范例是大腸桿菌BirA，它也是生物素生物合成途徑的阻遏蛋白。豬鏈球菌是豬疾病的主要細菌病原體，似乎是一種日益重要的人類機會性病原體。與大腸桿菌的情況不同，豬鏈球菌缺乏從頭生物素生物合成途徑。相反，它保留了bioY，一個編碼生物素轉運蛋白的基因，表明豬鏈球菌從其棲息地清除生物素的替代生存策略。本文報告了豬鏈球菌birA同源物的功能定義。通過其補充大腸桿菌birA條件致死突變體的能力，判斷了與大腸桿菌對應物僅有23.6%同一性的birA旁系同源物的體內功能。豬鏈球菌的重組BirA蛋白在大腸桿菌中過表達，純化至均一，并通過MS驗證。纖維素TLC和MALDI-TOFF-MS分析均證明豬鏈球菌BirA蛋白催化其受體生物素羧基載體蛋白的生物素化反應。EMSA分析證實bioY基因與豬鏈球菌BirA結合。數據定義了鏈球菌中雙功能BirA連接酶/阻遏蛋白的第一個例子。
引言
生物素（維生素H）是兩種已知的含硫脂肪酸衍生物（生物素和硫辛酸）之一，作為酶輔因子在生命三域中普遍存在。盡管需要生物素的酶是稀有蛋白質（哺乳動物只有四種這樣的蛋白質，而大腸桿菌只有一種生物素化蛋白質），但它們在原核生物和真核生物中脂肪酸合成、糖異生和氨基酸降解等某些重要反應（如羧化、脫羧和轉羧化）中起關鍵作用。目前已知大多數微生物（細菌和真菌）和植物具有合成生物素的能力，而哺乳動物和鳥類則不能。生物素合成的早期步驟涉及大腸桿菌中修飾的II型脂肪酸合成途徑，而生物素合成途徑的后期涉及分別由BioF、BioA、BioD和BioB催化的高度保守的四步反應。鑒于生物素是一種能量消耗大的分子，估計每個生物素的從頭合成途徑消耗約15-20個ATP當量，細菌似乎已經開發出多種機制來嚴格監測體內生物素生產水平。除了保留生物素蛋白連接酶活性的大腸桿菌BirA調控系統外，至少還有兩種調控機制被報道。其中一種是BirA與BioR（GntR家族轉錄因子）耦合的雙蛋白系統，另一種是BirA與BioQ（TetR家族轉錄因子）耦合的雙蛋白系統。
事實上，細菌進化出兩種不同的機制來獲得代謝所需的生物素輔因子，一種是從頭合成途徑，另一種是BioY轉運蛋白介導的吸收系統。與人類病原體布魯氏菌（一種編碼上述兩種系統以獲得生物素的α-變形菌）不同，鏈球菌/乳酸球菌家族的物種似乎只有基于BioY的清除途徑，并補償了從頭生物素合成途徑的缺乏。在微生物中，需要生物素的范例酶是生物素羧基載體蛋白（縮寫為BCCP，即乙酰輔酶A羧化酶的AccB亞基），它催化II型脂肪酸合成途徑的第一個關鍵反應。
生物素蛋白連接酶在生命三域中廣泛存在，因為它將生物素輔因子從某些中心代謝的關鍵酶的相關亞基的特定位點轉移/附著。包括大腸桿菌和芽孢桿菌在內的大多數細菌只編碼一個BPL來滿足這種生理需求，而病原體新兇手弗朗西斯菌開發了一個額外的BPL以在感染宿主環境中獲得競爭優勢。通常，BPL成員分為以下兩組（I組和II組），可以通過是否存在N端DNA結合域來輕松區分，該結構域允許BirA蛋白結合同源基因（例如，生物素操縱子），從而抑制生物素代謝的表達。與范例II組BPL蛋白（大腸桿菌birA基因產物保留DNA結合活性）不同，缺乏N端螺旋-轉角-螺旋結構域的I組BPL僅作為負責蛋白質生物素化的酶起作用。特別是，II組BPL的調控作用取決于生理配體/效應物（生物素酰-5'-AMP）的參與，這是生物素利用/蛋白質生物素化的第一個連接酶半反應的產物。
豬鏈球菌是世界范圍內豬產業中細菌性疾病（包括腦膜炎、關節炎和敗血癥）的主要病原體，并且似乎也是一種機會性人畜共患病原體，負責人類豬鏈球菌感染，如腦膜炎甚至鏈球菌中毒性休克樣綜合征。根據細菌莢膜的差異，35種血清型（1-34，1/2）被歸因于豬鏈球菌。其中，豬鏈球菌血清型2經常從患病仔豬中分離，并與強毒力高度相關。豬鏈球菌2型是一種先前被忽視但新出現的人類病原體，聲稱引起一系列職業/機會性感染。自從1968年在丹麥首次記錄人類SS2腦膜炎以來，SS2已傳播到近30個國家（和/或地區）并引起不少于1600例人類病例。特別是，中國曾發生過兩次大規模致命人類SS2感染暴發（一次在江蘇省，1998年，另一次在四川省，2005年），對公共衛生構成重大關注。2007年，我們還報告了中國三例散發性人類SS2腦膜炎病例（深圳市兩例，重慶市一例），暗示中國暴發和散發病例共存。不尋常的是，中國強毒SS2的流行菌株含有一個稱為89K的致病島。隨后的功能探索表明，這個89K PAI表現得像轉座子樣遺傳元件，并編碼IV型分泌系統和SezAT毒素-抗毒素系統。我們的流行病學調查認為，89K PAI可能正在經歷未知的選擇壓力，因為一些失去89K PAI的變體正在出現。細菌表面結構的重塑顯著減弱了流行SS2菌株的完全毒力。最近，我們觀察到D-半乳糖胺/N-乙酰-D-半乳糖胺分解代謝途徑的調控與其傳染性相關。細菌代謝的調控網絡似乎復雜地涉及SS2毒力。鑒于生物素代謝和利用與弗朗西斯菌致病性相關，定義人類病原體豬鏈球菌2型中的生物素利用途徑非常有趣。
在本文中，對中國流行SS2菌株，即具有已知基因組序列的豬鏈球菌05ZYH33，進行了細菌生物素代謝及其可能調控的背景分析。與范例生物大腸桿菌所見的情況不同，我們在豬鏈球菌中檢測到的可能生物素機制包括一個由BirA雙功能蛋白調控的單個BioY轉運蛋白和需要生物素的底物蛋白AccB。通過采用從比較基因組學、生物信息學、生物化學/生物物理學、代謝組學到細菌遺傳學的綜合方法，我們試圖呈現人畜共患病原體豬鏈球菌中生物素利用途徑的全貌。
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