2.2.通過RAPD-PCR進行菌株分型


對于每個分離株，將生長在MRS瓊脂上的一環細胞懸浮在200μl的6%Chelex®-100（Bio-Rad，赫拉克勒斯，加利福尼亞州，美國）中，在100°C加熱10分鐘，冰上冷卻，并在14,000 g下離心10分鐘。使用50微升上清液（含有DNA）作為PCR模板。使用隨機引物KS、M13R2、R5和CC1進行RAPD-PCR分析（表1）。每個25-μl PCR反應包含2.5μl的10x PCR緩沖液，3.5 mmol l-1的MgCl2，0.2 mmol l-1的每種dNTP，0.8μmol l-1的引物，1 mg ml-1的BSA，1 U的TAQ聚合酶（Invitrogen，梅勒爾貝克，比利時）和2μl的DNA。


表1：引物和PCR條件
引物 序列(5'-3') 靶基因 參考文獻 退火溫度(°C) 循環數
M13R2 GGAAACAGCTATGACCATGA 隨機引物 Martin et al. (2005a) 38 40
KS TCGAGGTCGACGGTATCG 隨機引物 Fulladosa et al. (2010) 40 40
CC1 AGCAGCGTGG 隨機引物 Cocconcelli et al. (1995) 33 40
R5 AACGCGCAAC 隨機引物 Martin et al. (2005a) 29 40
BSF8 AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG 16S rRNA 通用引物 50 40
BSF 343 TACGGGAGGAGCAG
BSF1541 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
sodA1 CCITAYICITATYAYGAYGCIYTIGARCC sodA Poyart et al. (2000) 37 35
sodA2 ARRTARTAIGCTGCYTCCCAIACRTC
H729 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC cpn60 Brousseau et al. (2001) 50 40
H730 AGCGGATAACAATTTCACACAGGAYKITYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
M13(-40)F CGCCAGGGTTTCCCAGTCACGACGAC 50 25
pheS-21-F CAYCCNCGHCGYGAYATGC pheS Naser et al. (2005) 46 35
pheS-22-R CCWARVCCRAARGCAAARCC
phe-S23-R GGRTGRACCATVCCNGCHCC 50 25

擴增程序包括在95°C下2分鐘，以及40個循環的變性在95°C下30秒（對于M13R2和KS）或1分鐘（對于CC1和R5），退火1分鐘（表1）和延伸在72°C下（M13R2和KS為1.5分鐘，CC1和R5為2分鐘），隨后在72°C下進行最終延伸5分鐘（引物M13R2）或7分鐘（引物KS、CC1和R5）。使用GeneAmp PCR System 2700（Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亞州，美國）。


PCR產物通過QIAxcel系統（QIAGEN，Hidden，德國）使用DNA篩查盒和AM320分離方法進行分離。使用InfoQuestTM FP軟件版本4.5（Bio-Rad Laboratories，赫拉克勒斯，加利福尼亞州，美國）對RAPD圖譜進行歸一化和分析。來自同一個嬰兒的分離株在RAPD分析中顯示相同條帶模式的被認為屬于同一基因型。


2.3.分離株的鑒定


每種基因型的一個或兩個分離株通過測序16S rRNA的V1-V3區域進行鑒定。不能在物種水平上鑒定的腸球菌屬、乳酸桿菌屬和魏斯氏菌屬，通過cpn60和/或pheS測序進行鑒定。鏈球菌物種通過sodA測序鑒定。每個50μl PCR反應包含5μl的10x PCR緩沖液，1.5 mmol l-1的MgCl2，0.4 mmol l-1的每種dNTP，0.5μmol l-1的每種引物（表1），2 U的TAQ聚合酶（Invitrogen）和5μl的Chelex®-100純化的DNA。使用Qiacube設備和QIAquick PCR純化試劑盒（QIAGEN）純化擴增子，并用BigDye Terminator 3.1循環測序試劑盒（Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亞州，美國）擴增5 ng。在ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）上進行測序。使用歐洲生物信息學研究所的在線BLAST-W2和ClustalW分析序列。


2.4.生長測定


使用Bioscreen C（Oy Growth Curves Ab Ltd，赫爾辛基，芬蘭）測試乳酸桿菌菌株的生長，使用以下肉湯：MRS-c（2%-葡萄糖MRS（Merck））、MRS-Salt（2%-葡萄糖MRS+2.5%w/v NaCl）、MRS-Nit（2%-葡萄糖MRS+150 ppm NaNO2）和MRS-mix（0.7%-葡萄糖MRS+2.5%w/v NaCl+150 ppm NaNO2）。所有肉湯都調節至pH 5.7。將乳酸桿菌的過夜培養物（37°C培養20小時）在相應培養基（MRS-c、MRS-Salt、MRS-Nit或MRS-Mix）中稀釋至10^6-10^7 CFU/ml，基于其OD600 nm值。將400μl等分試樣轉移到Bioscreen C板的孔中，每個樣品做三個重復。將板在Bioscreen C中于37°C（MRS-c、MRS-Salt和MRS-Nit）或20°C（MRS-c、MRS-Salt、MRS-Nit和MRS-mix）運行，直到微生物達到穩定期。為了盡量減少氧氣存在，用硅膠密封孔蓋。每30分鐘測量一次OD600 nm。對每種肉湯和培養溫度進行了三次獨立實驗。使用DMFit程序將生長數據調整到Baranyi和Roberts數學模型，獲得生長速率和延遲期等動力學參數。對于所有曲線，確定了檢測時間（TTD），即OD600 nm增加0.05所需的時間。


另外，研究了在含有和不添加黑胡椒（3 g/kg）的MRS肉湯（Merck）中以1%接種的乳酸桿菌在37°C培養24小時期間的生長情況。在開始培養后以及培養6小時和24小時后在MRS瓊脂（Merck）上進行平板計數。


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