潛在致病菌的生長。
圖4. 碳源對潛在致病菌生長的影響。通過生長曲線下面積（AUC）評估添加1% 2'-巖藻糖基乳糖（2'-FL）、3-巖藻糖基乳糖（3-FL）、二巖藻糖基乳糖（DFL）、巖藻糖（Fuc）、商業(yè)低聚半乳糖（GOS-c）、富集低聚糖的GOS（GOS-p）、乳糖（Lac）和葡萄糖（Glu）后潛在致病菌的生長情況。AUC值通過減去未添加碳水化合物的生長培養(yǎng)基中細菌的AUC值進行標準化。生長數(shù)據(jù)采用色標標注：深紅色代表強烈生長（AUC值范圍：1000-1700；500-999；200-499；100-199；36-99；0-35），深藍色代表生長低于培養(yǎng)基基準（AUC值范圍：-110至-1）。細菌菌株縮寫見表2。
潛在致病菌的碳水化合物利用結果以熱圖形式顯示在圖4中。與上文相同，每種細菌的每種碳源的AUC值減去了相應未添加碳水化合物的培養(yǎng)基的AUC值，并根據(jù)生長模式的相似性對細菌菌株進行聚類。
16種潛在致病菌形成了兩個主要簇。聚類受到所有研究的大腸桿菌菌株和產(chǎn)氣莢膜梭菌模式菌株（Cper_TS）對巖藻糖的利用以及在3-FL上的輕微生長，以及阪崎克羅諾桿菌模式菌株（Csak_TS）在3-FL上的輕微生長的影響。此外，上述所有物種和阪崎克羅諾桿菌BAA-94（Csak_BAA-894，一種人類臨床分離株）在GOS-c、GOS-p、乳糖和葡萄糖上生長良好。
2'-FL和DFL不支持任何潛在致病菌的生長。我們觀察到大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和阪崎克羅諾桿菌在3-FL上有極弱或弱生長，這在生長實驗開始時觀察到，并緩慢下降，在24小時時與培養(yǎng)基對照相比幾乎無差異。這可能是受到3-FL產(chǎn)品中少量殘留乳糖和半乳糖（見表1）的影響。
表1：碳源的結構、成分和供應商| 碳水化合物 | 類型 | 縮寫 | 純度 | 供應商 |
|---|---|---|---|---|
| 2'-巖藻糖基乳糖, Fuc a1-2 Galβ1-4 Glu | 三糖 | 2'-FL | 2'-FL 99% | 杜邦營養(yǎng)與生物科學公司 |
| 3-巖藻糖基乳糖, Galβ1-4 Glu a1-3 Fuc | 三糖 | 3-FL | 3-FL 96%, 乳糖 2.5%, 半乳糖 0.3% | 杜邦營養(yǎng)與生物科學公司 |
| 二巖藻糖基乳糖, Fuc a1-2 Galβ1-4 Glu a1-3 Fuc | 四糖 | DFL | DFL 97%, 3-FL 0.1%, 2'-FL 2.1% | 杜邦營養(yǎng)與生物科學公司 |
| 巖藻糖 | 單糖 | Fuc | 巖藻糖 99.5% | 杜邦營養(yǎng)與生物科學公司 |
| Bimuno GOS | 多糖 | GOS-c | GOS 81%, 葡萄糖 5.4%, 乳糖 12.3% | Clasado Biosciences |
| 乳糖 | 二糖 | Lac | 用于微生物學 | Merck |
| 葡萄糖 | 單糖 | Glu | ACS級 | J.T. Baker |
注：GOS=低聚半乳糖；Gal=半乳糖
幾種腸桿菌科能很好地利用單糖和二糖，這表明存在與HMOs利用者（尤其是兩歧雙歧桿菌和擬桿菌屬）交叉喂養(yǎng)的可能性，這些菌株在細胞外降解HMO結構并釋放較小的單糖、二糖和寡糖。或者，已知產(chǎn)氣莢膜梭菌含有1,3-1,4-α-L-巖藻糖苷酶，能夠從粘蛋白中釋放巖藻糖，表明其具有切割巖藻糖的能力，也可能作用于3-FL。相反，Yu等人未觀察到大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌或腸桿菌屬在48小時后3-FL與培養(yǎng)基對照之間的任何差異。
所有大腸桿菌菌株和產(chǎn)氣莢膜梭菌模式菌株（Cper_TS）利用了巖藻糖，而兩種阪崎克羅諾桿菌菌株則沒有，這與先前的研究結果一致。阪崎克羅諾桿菌是配方奶粉中常見的病原體。觀察到大腸桿菌菌株對巖藻糖利用的變異性；模式菌株（Ecol_TS，來自尿液）和菌株NCTC10865（Ecol_NCTC10865，來自腹瀉嬰兒的糞便）在巖藻糖上生長良好，但不如在葡萄糖上好。菌株CCUG11412（Ecol_CCUG11412，來自嬰兒腸胃炎）和CCUG42878（Ecol_C-CUG42878，來自嬰兒腸胃炎）對葡萄糖和巖藻糖的利用程度相同，而菌株CCUG11442（Ecol_C-CUG11442，來自嬰兒腹瀉）在巖藻糖上的生長優(yōu)于葡萄糖。因此，大腸桿菌菌株之間在利用巖藻糖的能力上存在差異。巖藻糖利用已被認為對致病性大腸桿菌EHEC菌株的定植至關重要；因此，兩歧雙歧桿菌和擬桿菌屬對HMOs和其他聚糖的利用（它們在細胞外切割巖藻糖）可能有助于EHEC的毒力。
此外，在本研究中，沙門氏菌菌株對巖藻糖的消耗情況各不相同。三種沙門氏菌菌株中有兩種在巖藻糖上生長：鼠傷寒沙門氏菌腸道亞種模式菌株（Sent_TS，來源未知）和波那沙門氏菌腸道亞種菌株NCTC4840（Sent_NCTC4840，來自嬰兒腸炎），而鼠傷寒沙門氏菌腸道亞種菌株NCTC13954（Sent_NCTC13954，來自人類糞便）則沒有。先前的研究表明，所有已知的沙門氏菌腸道菌株都含有巖藻糖利用操縱子。我們發(fā)現(xiàn)菌株NTCT13954（血清型鼠傷寒）未在巖藻糖上生長，這表明巖藻糖操縱子的表達存在變異性，至少在實驗條件下是如此。
所有大腸桿菌菌株、產(chǎn)氣莢膜梭菌模式菌株（Cper_TS）和兩種阪崎克羅諾桿菌菌株在GOS-c和GOS-p上都生長良好。這些結果與早期顯示這些細菌在GOS和乳果糖上生長的一項研究一致，以及其他顯示大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌在GOS和乳糖上生長的研究。然而，另一項研究未發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在GOS上生長。總體而言，在我們的研究中，大腸桿菌在商業(yè)和純化GOS上都生長良好，并且根據(jù)菌株的不同，生長優(yōu)于或等于在葡萄糖上觀察到的生長。所有在葡萄糖上生長并在GOS-c上微弱生長的艱難梭菌、福氏志賀氏菌和沙門氏菌菌株均未在GOS-p上生長，GOS-p含有很少的單糖和二糖，表明它們無法利用純GOS產(chǎn)品。此外，無法在GOS-p上生長通常伴隨著無法在乳糖上生長。所有研究的大腸桿菌菌株都在乳糖上生長。早期的研究表明，非致病性大腸桿菌菌株不利用乳糖，而模式菌株已被證明可以利用乳糖。
福氏志賀氏菌的結果與先前一項研究的結果相似，該研究發(fā)現(xiàn)痢疾志賀氏菌僅在葡萄糖和GOS上生長。腸桿菌科對不同GOS產(chǎn)品利用的改變也已被觀察到。先前很少有研究評估潛在致病菌在GOS等益生元上的生長。不同GOS產(chǎn)品的組成各不相同，這也可能導致細菌菌株在利用GOS方面的依賴性差異。
在最近的一個單一培養(yǎng)模型中，乳糖和GOS都增加了產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長。艱難梭菌模式菌株（Cdif_TS）的總體生長較弱，使得與其他菌株進行比較變得不可能。
巖藻糖的利用將這群潛在致病菌分為兩個簇。在2'-FL和DFL上未發(fā)現(xiàn)生長，而一些細菌可能能夠利用3-FL，盡管效率不高。利用巖藻糖基化HMO需要特定的酶，特別是1,2-a-L-巖藻糖苷酶，這可以在一些特定的嬰兒共生菌中找到。HMOs作為選擇性營養(yǎng)素，可以保護嬰兒免受病原體侵害。從GOS中去除大部分單糖和二糖阻止了沙門氏菌屬和志賀氏菌屬的生長。
所有細菌的聚類和結論。
為了可視化所有研究的57種細菌的聚類，對所有處理的相關矩陣進行了主成分分析（圖5）。提取了前四個主成分，它們解釋了數(shù)據(jù)中95%的方差。基于提取的主成分將菌株聚類為六個簇。
圖5. 基于測試碳水化合物生長的細菌聚類分析：2'-巖藻糖基乳糖、3-巖藻糖基乳糖、二巖藻糖基乳糖、巖藻糖、乳糖、葡萄糖，以及商業(yè)級與純化形式的低聚半乳糖（GOS）。
然而，當所有各種細菌物種合并時，HMO的利用是決定簇的主要因素。簇4包含在巖藻糖基化HMOs上明顯生長的細菌：嬰兒雙歧桿菌Bi-26（Binf_Bi-26）、兩歧雙歧桿菌Bb-06（Bbif_Bb-06）、假小鏈雙歧桿菌模式菌株（Bpse_TS）、脆弱擬桿菌模式菌株（Bfra_TS）和普通擬桿菌模式菌株（Bvul_TS）。簇2、3和5都包含未在HMOs和巖藻糖上生長但在所有其他研究的碳源上生長的細菌。這些簇之間的差異與簇5中在葡萄糖、乳糖和兩種GOS產(chǎn)品上的強生長有關；簇3中在純化GOS上的生長相比商業(yè)GOS減少；以及簇2中在葡萄糖、乳糖和GOS上的總體生長減少。嬰兒雙歧桿菌模式菌株（Binf_TS）也被包括在簇5中，可能是由于其在GOS上的強生長。然而，該物種在圖表中被分組到更靠近其他HMO利用者，而不是那些無法利用HMOs的物種。簇6包含利用巖藻糖的細菌，簇1包括要么總體生長低要么主要在葡萄糖上生長的細菌。
一些碳水化合物比較研究使用了貧瘠培養(yǎng)基，例如ZMB1，以避免復雜的培養(yǎng)基成分（包括酵母或牛肉提取物）可能通過在沒有碳源的情況下為背景生長提供營養(yǎng)而影響結果。因為我們評估了具有不同營養(yǎng)需求的異質(zhì)細菌群，我們希望細菌在各自的最佳培養(yǎng)基中生長，這允許在組內(nèi)和組間進行比較。我們的主要目的是檢查細菌生長的差異，我們研究了三種HMOs、其他常用益生元以及寡糖組分對大量雙歧桿菌、乳桿菌科和潛在致病菌的影響。評估純培養(yǎng)物生長的方法既可靠又可重復，但也存在差異。Yu等人報告了48小時細菌生長后600 nm處光密度的變化，Hoeflinger等人報告了24-96小時細菌生長期間600 nm處最大光密度的變化。我們選擇使用AUC來評估每種細菌菌株的生長，因為該參數(shù)還考慮了延遲時間、總體生長強度和生長速率。將數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為AUC值也使得更容易在各種碳源之間進行比較。對純細菌培養(yǎng)物在各種底物存在下生長的深入了解使得能夠估計在更復雜條件下碳水化合物的利用和交叉喂養(yǎng)。將來，可以利用有限數(shù)量的細菌物種/菌株組合使用碳水化合物混合物來研究交叉喂養(yǎng)動態(tài)。
目前的工作強調(diào)了評估益生菌和病原菌菌株特異性差異的重要性。由于HMOs越來越多地被添加到嬰兒配方奶粉中，將HMOs的益生元效果與其他益生元（如GOS）的效果進行比較變得更加重要。
HMOs的利用增加了母乳喂養(yǎng)嬰兒中雙歧桿菌的豐度。運輸和降解巖藻糖基化HMO結構的能力對于這一過程至關重要。目前的工作支持這一模型，因為只有選定的雙歧桿菌和擬桿菌利用了巖藻糖基化HMOs，而其他研究的細菌（例如病原菌）則沒有。還觀察到潛在致病菌在巖藻糖和GOS利用方面的差異。
這些結果顯示了與HMOs相關的選擇性以及各種益生菌和病原菌之間益生元消耗的差異。HMOs的選擇性可能有利于嬰兒腸道微生物群的進化，通過促進有益微生物的生長，同時不支持有害病原體的生長，這與其他選擇性較差的益生元形成對比。
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